Cirkulujúce nádorové bunky: biológia a klinický význam - Imuno-Alergo

• Danfeng Lin, • Lesang Shen, • Meng Luo, • Kun Zhang, • Jinfan Li, • Qi Yang, • Fangfang Zhu, • Dan Zhou, • Shu Zheng, • Yiding Chen & • Jiaojiao Zhou
Transdukcia signálu a cielená terapia objem 6 , Číslo článku: 404 ( 2021 ) Citovať tento článok
• 70 000 prístupov
• 358 citácií
• 87 Altmetric
• Metrikypodrobnosti

Abstraktné
Cirkulujúce nádorové bunky (CTC) sú nádorové bunky, ktoré sa oddelili od primárneho nádoru a extravazujú do krvi a cirkulujú v krvi. Pochopenie metastatickej kaskády CTC má obrovský potenciál na identifikáciu cieľov proti rakovinovým metastázam. Detekcia týchto veľmi zriedkavých CTC medzi masívnymi krvnými bunkami je náročná. Nové technológie na detekciu CTC však výrazne prispeli k prehĺbeniu výskumu biológie CTC a uľahčili ich klinickú aplikáciu. Súčasné technológie na detekciu CTC sú tu zhrnuté spolu s ich výhodami a nevýhodami. Detekcia CTC je zvyčajne závislá od molekulárnych markerov, pričom adhézna molekula epiteliálnych buniek je najpoužívanejšia, hoci molekulárne markery sa medzi rôznymi typmi rakoviny líšia. V CTC boli identifikované vlastnosti spojené s epitelovým-mezenchymálnym prechodom a kmeňovosťou, čo naznačuje ich zvýšenú metastatickú kapacitu. Len malá časť CTC môže prežiť a prípadne iniciovať metastázy, čo naznačuje, že interakcia a modulácia medzi CTC a nepriateľským krvným mikroprostredím je nevyhnutná pre metastázy CTC. Jednobunkové sekvenovanie CTC bolo rozsiahle skúmané a umožnilo výskumníkom odhaliť genóm a transkriptóm CTC. V tomto dokumente tiež skúmame klinické aplikácie CTC, najmä na monitorovanie odpovede na liečbu rakoviny a pri hodnotení prognózy. Preto CTC majú a budú naďalej prispievať k poskytovaniu významných poznatkov o metastatických procesoch a otvoria nové cesty pre užitočné klinické aplikácie.

Podobný obsah si prezerajú ostatní

Biológia, zraniteľnosti a klinické aplikácie cirkulujúcich nádorových buniek

Článok 9. decembra 2022

Cirkulujúce nádorové bunky na včasnú detekciu klinicky relevantnej rakoviny

Článok 2. júna 2023

Článok Otvorený prístup2. októbra 2019

Úvod
Metastázy sú najsmrteľnejším znakom rakoviny 1 . Napriek významnému vývoju v diagnostike a liečbe rakoviny v posledných storočiach zostávajú metastázy hlavnou prekážkou zlepšenia klinických výsledkov u pacientov s rakovinou 2 . Napriek tomu sme za posledných dvesto rokov boli svedkami významného pokroku v odhaľovaní základných konceptov, ktoré sú základom vývoja metastáz, a vo vytváraní nových technológií na uľahčenie výskumu metastáz rakoviny. Obr . 1 zdôrazňuje kľúčové objavy a míľniky v štúdiu metastáz rakoviny. Hypotéza „semena a pôdy“ Stevena Pageta 3 z 30. rokov 19. storočia názorne objasnila postup metastázovania rakoviny. S pokrokom vedy a technológií, najmä od roku 2000, sa vyvinulo množstvo nových technológií, ako napríklad vysokovýkonné sekvenovanie 4 , 5 , modely transgénnych myší 6 , editačné nástroje CRISPER/Cas9 7 a jednobunkové sekvenovanie 8 . Vďaka týmto výkonným technológiám sa biologické javy, ktoré sú základom metastáz, ako je epitelovo-mezenchymálny prechod (EMT) nádorových buniek 9 , úloha exozómov pri podpore metastáz 10 , cirkulujúce nádorové bunky (CTC) a zhluky CTC pri očkovaní metastatických kolónií 11 a komplexné interakcie medzi nádorovými bunkami a mikroprostredím 12 sa postupne odmaskovali spolu s objavom mnohých hnacích génov súvisiacich s metastázami. „Čierna skrinka“ metastáz sa postupne odhaľuje a predpokladá sa, že v blízkej budúcnosti budú na obzore účinné látky zacielené na metastázy.

Historické míľniky výskumu metastáz rakoviny

Rakovinové metastázy sú komplexný viacstupňový proces zahŕňajúci inváziu rakovinových buniek do primárneho miesta, intravazáciu do obehu, prežitie v obehu, extravazáciu z obehu a pripojenie a kolonizáciu metastatického miesta (obr. 2 ). CTC sú definované ako nádorové bunky, ktoré sa oddelili z primárneho nádoru a sú odplavené obehovým alebo lymfatickým systémom. Doteraz sa väčšina výskumov CTC zameriavala na CTC v krvnom obehu. CTC boli prvýkrát opísané v roku 1869 Ashworthom, ktorý pozoroval „niektoré bunky“ v krvi pacienta s metastatickým karcinómom, ktorý mal podobný vzhľad ako nádorové bunky v primárnych nádoroch 13 . Predpokladá sa, že CTC sú substrátom metastáz. Hoci CTC pochádzajú z primárneho nádoru, odlišujú sa od primárnych nádorových buniek 14 , s prechodovými vlastnosťami EMT, ktoré im pomáhajú oslobodiť sa od primárneho nádoru a uľahčujú intravazáciu do krvného obehu, šírenie v zhlukoch CTC na zvýšenie metastatického potenciálu a prejavujú stopku. vlastnosti, ktoré zvyšujú ich schopnosť iniciovať metastázy (obr. 2 ). Väčšina CTC však zahynie v obehu a iba obmedzené CTC prežijú a infiltrujú vzdialené orgány. Interakcie medzi CTC a krvným prostredím (obr. 2 ), vrátane toho, ako CTC unikajú imunitnému dohľadu v krvi, sa široko podieľajú na metastatických mechanizmoch CTC. Trvalo viac ako storočie, kým výskumníci rozpoznali kritickú úlohu CTC pri metastázovaní rakoviny kvôli jedinečným technickým výzvam potrebným na izoláciu týchto veľmi vzácnych CTC z masívnej zásoby cirkulujúcich krviniek 15 . V posledných dvoch desaťročiach však nové technológie na izoláciu CTC umožnili výskum biológie CTC a uľahčili klinické aplikácie CTC pri skríningu rakoviny, monitorovaní odpovede na liečbu a hodnotení prognózy.

Cirkulujúce nádorové bunky: biológia a klinický význam

Viacstupňový proces metastázovania rakoviny. Komplexný metastatický proces zahŕňa inváziu nádorových buniek do primárneho miesta, intravazáciu do obehu, prežitie v obehu ako CTC a interakciu s krvnými bunkami, extravazáciu z obehu, pripojenie a kolonizáciu metastatického miesta. EMT: prechod z epitelu na mezenchymálny, CAF: fibroblast spojený s rakovinou, TAM: makrofág spojený s nádorom.
V tomto prehľade je plne preskúmaná biológia CTC, ako aj ich interakcia s mikroprostredím krvi. Okrem toho bude zhrnutý rastúci počet vysoko sofistikovaných technológií na obohacovanie a izoláciu CTC. Nakoniec diskutujeme aj o obrovskom potenciáli CTC v klinických aplikáciách.

Biológia CTC
Molekulárna charakterizácia CTC
Experimentálne dôkazy podporili názor, že nádorové bunky sa môžu šíriť aj počas skorých štádií vývoja nádoru16,17 . Molekulárna charakterizácia CTC pridá poznatky k základnému mechanizmu metastatických procesov, čím prispeje k včasnej diagnóze a prevencii metastáz.

Molekulové markery CTC
Panel molekulárnych markerov sa použil na detekciu CTC pri rôznych rakovinách. CTC-asociované markery používané pre rôzne rakoviny sú zhrnuté v tabuľke 118,19 . Keďže väčšina rakovín je epitelového pôvodu, najbežnejším markerom používaným pre CTC je EpCAM, „univerzálny“ epiteliálny marker rakovín20 . Expresia EpCAM sa líši medzi rôznymi typmi rakoviny 21 a technológie detekcie CTC založené na EpCAM sa široko používajú pri rakovinách, ktoré silne exprimujú EpCAM, ako je rakovina prsníka a prostaty. Mnohé štúdie ukázali, že CTC pri rakovine prsníka a prostaty sú EpCAM-pozitívne a potvrdili ich prognostickú hodnotu v prípadoch skorého alebo metastatického štádia22,23 . Iné typy rakoviny odvodené od epitelu, ako napríklad rakovina pankreasu24 , kolorektálna rakovina25 a hepatocelulárna rakovina26 , majú tiež značnú mieru detekcie EpCAM-pozitívnych CTC. Podobne prítomnosť týchto EpCAM-pozitívnych CTC predpovedá skoré vzdialené metastázy a horšie prežívanie pacientov 25 , 27 , 28 . Použitie EpCAM ako CTC markera má však obmedzenia. Nemôže sa použiť v nádoroch, ktoré sú EpCAM-negatívne alebo s nízkou expresiou, ako sú neurogénne rakoviny. CTC môžu podstúpiť EMT a epitelové markery, vrátane EpCAM, sú počas EMT regulované smerom nadol, čo ovplyvňuje mieru detekcie EpCAM-pozitívnych CTC. Hoci existujú pochybnosti o tom, či sú technológie založené na EpCAM vhodné na detekciu všetkých CTC, početné štúdie ilustrovali potenciálnu hodnotu EpCAM-pozitívnych CTC v klinických aplikáciách 29 . Do určitej miery sú EpCAM-pozitívne CTC podstatnou podskupinou všetkých CTC, takže EpCAM-pozitívne CTC by stále mohli byť spoľahlivým biomarkerom, ak je prognóza rakoviny a terapeutická účinnosť relevantná pre EpCAM-pozitívne CTC.

Tabuľka 1 Molekulárne markery používané na identifikáciu CTC

V dôsledku EMT aktivity niektorých epiteliálnych rakovinových buniek detegovanie iba EpCAM-pozitívnych CTC pravdepodobne podhodnocuje skutočnú celkovú populáciu CTC a chýba dôležité biologické informácie o EpCAM-negatívnych CTC. Pri niektorých typoch rakoviny, ako sú pacienti s nemalobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC), sa dokonca zistilo, že množstvo EpCAM-negatívnych CTC bolo významne väčšie ako EpCAM-pozitívnych CTC30 . Zlá izolácia CTC technológiami založenými na EpCAM sa však dá zachrániť použitím epiteliálnych aj mezenchymálnych markerov rakoviny, ako aj detekčných metód nezávislých od markerov. Napríklad pri rakovine prsníka použitie fluorescenčných magnetických nanočastíc pozostávajúcich z rozhrania s dvojitou protilátkou zacieleného na EpCAM aj N-kadherín prispelo k vysoko účinnej izolácii a rýchlej identifikácii CTC31,32 . Pri rakovine žlčových ciest umožnil jednobunkový test na detekciu CTC identifikáciu epitelových CTC aj nekonvenčných CTC, ktorým chýbali epiteliálne a leukocytové markery, a preto viedol k zvýšeniu miery pozitivity CTC33 . Program EMT rakovinových buniek vykazuje molekulárne zmeny, vrátane zníženej expresie epitelových markerov (E-kadherín, ZO-1, klaudíny a okludíny) a zvýšenej expresie mezenchymálnych markerov (vimentín, N-kadherín, fibroblast-špecifický proteín1 a fibronektín ) 34 . EMT sa vykonáva transkripčnými faktormi súvisiacimi s EMT, ktoré patria najmä do rodín SNAIL, TWIST a ZEB34 . Všetky tieto molekuly súvisiace s EMT možno teoreticky použiť na metódy zacielenia EMT-CTC. Mnohé molekuly súvisiace s EMT sú však cytoplazmatické alebo jadrové proteíny, čo vylučuje ich použitie v v súčasnosti dostupných technológiách detekcie CTC založených na membránových molekulách. Proteíny ako E-kadherín, vimentín a twist boli najčastejšie používané v minulosti 35 (tabuľka 1 ), pravdepodobne kvôli ich dostupnosti detekcie v tradičných CTC detekčných technológiách vrátane triedenia prietokovou cytometriou, imunofarbenia a fluorescenčnej in situ hybridizácie (FISH ) farbenie. Vznik jednobunkových CTC sekvenčných technológií 36 však umožní komplexnejšie demaskovať stav EMT CTC a môže pokryť všetky molekulárne zmeny súvisiace s EMT na úrovni RNA.

Iné biomarkery, ako je ľudský receptor epidermálneho rastového faktora-2 (HER2) 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , estrogénový receptor 39 , 48 , 49 , 50 špecifický pre prostatu membránový antigén 51 , 52 , 53 , folátový receptor 54 , 55 , 56 a survivín 57 , boli opísané ako CTC markery pri rôznych rakovinách s rôznym klinickým významom. Tieto CTC markery špecifické pre rakovinu sú uvedené v tabuľke 1 . Väčšina týchto CTC markerov špecifických pre rakovinu je v súlade so špecifickými molekulárnymi markermi primárneho nádoru. Existuje však nesúlad v expresii špecifických markerov medzi primárnym nádorom a CTC. Napríklad miera nesúladu amplifikácie génu HER2 medzi CTC a primárnym nádorom prsníka bola okolo 15 % 58 , čo naznačuje klonálnu selekciu CTC alebo klonálnu akvizíciu, pravdepodobne v dôsledku genetickej nestability. Malo by sa spomenúť, že v prípade melanómu, rakoviny kože, ktorá začína v melanocytoch, sú technológie detekcie CTC založené na niekoľkých adhéznych molekulách melanómových buniek, ako sú HMW-MAA 59 , 60 , 61 , MART-1 62 , 63 , 64 , CD14661,65 a MAGE A362,63,66 , čo sú veľmi špecifické molekulárne markery pre melanóm .
Rozmanitosť markerov CTC naznačuje heterogenitu CTC medzi rôznymi typmi rakoviny. Dokonca aj u jedného pacienta sú CTC priestorovo-časovo heterogénne, čo môže byť výsledkom priestorovo odlišného mikroprostredia v krvi a časových zmien v terapeutickej odpovedi. Preto je ťažké definovať celú populáciu CTC pomocou veľmi obmedzených molekulárnych markerov, ktoré sú v súčasnosti dostupné. Okrem toho by CTC markery nemali byť konštantné medzi rôznymi štádiami rakoviny a obdobiami liečby.

Analýza genómu CTC
Genomická nestabilita prispieva k evolúcii nádoru a vzniku rezistentných nádorových subklonov. Monitorovanie genómovej nestability nádoru, najmä z hľadiska nádorovej rezistencie a metastáz, výrazne prispieva k hodnoteniu odpovede na liečbu a precíznej medicíne. Vyhodnotenie hodnotenia CTC pomocou neinvazívnej tekutej biopsie je dostupné pre sériové odbery vzoriek na detekciu genómovej nestability nádoru.

Určenie stavu mutácií EGFR a KRAS je kľúčové pre vedenie liečby u pacientov s NSCLC, ktorí dostávajú inhibítory tyrozínkinázy EGFR, a u pacientov s kolorektálnym karcinómom liečených anti-EGFR terapiou. Veľkú pozornosť pritiahla zhoda mutácií medzi CTC a zodpovedajúcim primárnym alebo metastatickým nádorovým tkanivom. Pomocou mikrofluidnej techniky na zachytenie CTC, Maheswaran et al. zistili , že iba dvaja z 31 pacientov s mutáciami boli z ich detekčného testu prehliadnutí67 . Identifikovali aktivačnú mutáciu EGFR v CTC u 92 % metastatických pacientov s NSCLC a zistili mutáciu T790M rezistentnú na liek v CTC u 33 % pacientov, ktorí reagovali na liečbu inhibítorom tyrozínkinázy, a u 64 % pacientov, ktorí vykazovali klinickú progresiu67 . Na analýzu mutácie génu KRAS sa miera zhody mutácií medzi CTC a zodpovedajúcimi primárnymi nádormi pohybovala od 37 % do 90 % v prípadoch kolorektálneho karcinómu 68 , 69 , 70 , 71 . Tento rozdiel v miere zhody môže byť spôsobený rôznymi protokolmi výberu CTC použitými v týchto štúdiách. Mutácie KRAS sú bežné aj pri pankreatickom duktálnom adenokarcinóme (PDAC), prítomných v 90 % prípadov PDAC. Kulemann a spol. zistili, že miera nesúladu mutácie KRAS v CTC a zodpovedajúcich nádoroch PDAC bola 42 % 72 . Štúdie analýzy génových mutácií v CTC sa uskutočnili aj pri mnohých rakovinách, ako je rakovina prostaty 73 , 74 , rakovina prsníka 75 , 76 , hepatocelulárne karcinómy 77 a často sa zistila mutačná nezhoda medzi CTC a zodpovedajúcimi nádormi. Miera nesúladu bola pravdepodobne pripísaná odlišnej účinnosti detekcie mutácií CTC alebo heterogenite medzi CTC a primárnymi nádorovými bunkami. Genomické hodnotenie nádorového tkaniva a CTC môže byť komplementárne. Takže kombinácia mutačného testovania CTC a vzoriek nádorov by presnejšie usmerňovala liečbu.
Určenie zmien počtu kópií (CNA) CTC pomáha analyzovať a sledovať profily rakoviny, keď sa nádory vyvíjajú. Pri rakovine pľúc Ni a spol. 78 zistili, že CTC vykazujú reprodukovateľné vzory CNA, podobné vzorom metastatických nádorov, a rôzni pacienti zdieľali podobné vzory CNA. V prípade malobunkového karcinómu pľúc klasifikátor pre CTC založený na CNA správne priradil 83,3 % pacientov ako chemorefraktérnych alebo chemosenzitívnych 79 . Pri rakovine prsníka je hodnotenie CNA v archivovaných CTC uskutočniteľné. Paoletti a kol. 80 zistili, že CNA CTC a spárované metastatické nádorové tkanivo u pacientov s rakovinou prsníka boli vysoko zhodné, hoci CTC a zodpovedajúce nádorové tkanivo obsahovali niekoľko nezhodných zmien v počte kópií, čo naznačuje, že CTC boli subklonové bunky nádorových tkanív. Pri trojnásobne negatívnej rakovine prsníka sú CTC s chromozómom 10 a 21q CNA prediktívne pre klinickú progresiu a ich sieťová analýza predstavila prepojené moduly vrátane signalizácie HER/fosfatidylinozitol-4,5-bisfosfát 3-kinázy/RAS/ JAK81 . Pri rakovine prostaty Lambro a spol. 82 odhalili, že CNA CTC boli medzi pacientmi a medzibunkovými heterogénnymi a mohli byť vynechané v analýzach hromadnej biopsie. Pri metastatickej kastrácii rezistentnej rakovine prostaty analýza počtu kópií celého genómu CTC ukázala, že bežné genómové zisky v CTC zahŕňali gény, ako je androgénny receptor (AR), mezenchymálny-epiteliálny prechod (MET), ERG a cyklín-dependentná kináza 12 , zatiaľ čo bežné genómové straty boli pozorované v génoch, ako je homológ fosfatázy a tenzínu (PTEN), RAF1 a GATA283 . Podobne Malihi a kol. tiež pozorovali, že CNA v génoch vrátane PTEN, RB1, TP53 a AR úzko súvisia s genómovou nestabilitou a prežitím pri agresívnom variante rakoviny prostaty84 .

V CTC sa uskutočnili aj iné analýzy genómu. Testovanie FISH bolo prijaté v CTC na detekciu biomarkerov citlivosti na liečbu, ako je testovanie ALK FISH v CTC pacientov s NSCLC85 a testovanie HER2 FISH v CTC pacientov s rakovinou prsníka86,87 . Nedávno sa na základe techniky analýzy metylácie DNA s jednobunkovým rozlíšením odhalil metylóm DNA jednotlivých CTC a CTC klastrov u pacientov s rakovinou prsníka a naznačil, že získaný hypometylačný profil CTC klastrov bol spojený so zlou prognózou a že liečba Inhibítory Na+/K+-ATPázy na disociáciu CTC klastrov by mohli zvrátiť metylačný profil CTC klastrov a potlačiť metastázy88 .

Transkriptómová analýza CTC
Jednobunkové sekvenovanie sa v posledných rokoch rýchlo rozvinulo a použilo sa na skúmanie transkriptómov CTC. Jednobunkové expresné profily môžu odlíšiť CTC od mezoteliálnych buniek a krvných buniek v pľúcnom adenokarcinóme, s reprezentatívnymi markermi vrátane EpCAM pre CTC89 . Analýza transkriptómu založená na jednobunkovom sekvenovaní odhalila heterogenitu v subpopulácii CTC. Testovaním expresie génov spojených s proliferáciou, ako je proliferačný marker Ki-67, Magbanua et al90 . zistili, že 65 % CTC u pacientov s metastatickým karcinómom prsníka malo nízku proliferáciu Ki-67 a že 35 % pacientov s vysokou proliferáciou expresie Ki-67 malo zlú prognózu. Cheng a kol. 91 vykonali jednobunkovú transkriptómovú analýzu 666 CTC u pacientov s metastatickým karcinómom prsníka. Zistili, že intra-pacientské CTC boli heterogénne, pokiaľ ide o stavy podobné EMT a MET, a CTC boli obohatené o fenotyp podobný kmeňu91 . Jednobunkové sekvenovanie CTC tiež výrazne pomohlo pri objavovaní signálnych dráh vodičov, ktoré prispeli k metastázam a zlyhaniu liečby. RNA-Seq jedného CTC prostaty indikovala aktiváciu nekanonickej Wnt signalizácie u pacientov rezistentných na antiandrogén92 . Ďalej, s použitím myšacích modelov, ektopická expresia Wnt5a zoslabila účinky AR inhibítora a supresia Wnt5a by mohla čiastočne obnoviť citlivosť buniek rakoviny prostaty rezistentných na liečivo92 . CTC boli spojené so zlou prognózou pri kolorektálnom karcinóme. Štúdia CTC-špecifického transkriptómového profilu 93 u šiestich pacientov s metastatickým kolorektálnym karcinómom charakterizovala 410 CTC-špecifických génov, ktoré primárne súviseli s bunkovým pohybom a adhéziou, ako je VCL ITGB5, kostný morfogenetický proteín 6, transformujúci rastový faktor beta 1 a talín 1 a súviseli s bunkovou smrťou a proliferáciou, ako je prekurzorový proteín amyloidu beta, klusterín a TIMP1.

Epitelový-mezenchymálny prechod CTC
EMT je proces, pri ktorom epitelové nádorové bunky strácajú svoju medzibunkovú adhéziu a získavajú mezenchymálne a invazívne vlastnosti. Počas šírenia sa nádorové bunky oddeľujú od bazálnej membrány prostredníctvom aktivácie EMT a priamo vstupujú do obehu, pričom slúžia ako CTC putujúce do vzdialených miest. Keď CTC extravazujú, podstúpia reverzný proces nazývaný MET a proliferujú za vzniku makrometastáz94,95,96 . Metastatický vývoj tu závisí od jemnej rovnováhy prechodu medzi týmito dvoma fenotypmi. Činnosť EMT-MET bola tiež navrhnutá tak, aby zohrávala dôležitú úlohu v metastatickom procese CTC97 . Pomocou myších modelov sa zistilo, že CTC epitelového typu s obmedzeným mezenchymálnym prechodom mali najsilnejšiu kapacitu tvorby pľúcnych metastáz, zatiaľ čo CTC mezenchymálneho typu vykazovali obmedzenú metastatickú schopnosť98 . Pri rakovine prsníka CTC vykazujú dynamické zmeny v zložení EMT a zistilo sa, že mezenchymálne CTC sú úzko spojené s progresiou rakoviny9,98 . Množstvo štúdií ukázalo zvýšenú EMT CTC skôr ako primárnych nádorových buniek pri rôznych rakovinách99 , 100 , 101 , 102 , 103 . V štúdii založenej na bioinformatickej analýze siedmich súborov génových čipov Guan a kol. ukázali, že v porovnaní s primárnymi nádormi sa hlavné zmeny v CTC týkali bunkovej adhézie, EMT a apoptózy104 . V prospektívnej štúdii zahŕňajúcej 39 pacientok s invazívnym karcinómom prsníka Tashireva et al. pozorovali väčšinu heterogénnych CTC fenotypov (22 z 24 detegovateľných vzoriek) vykazujúcich plasticitu EMT105 . Zaujímavé je, že sa zistilo, že šmykové napätie tekutiny môže indukovať EMT CTC prostredníctvom JNK signalizácie pri rakovine prsníka, čo ďalej potvrdilo vzťah medzi rozšíreným EMT CTC a zlým prežitím pacientov 106 .
Klinicky môže byť kombinácia celkového počtu CTC a podielu mezenchymálnych CTC107 použitá na monitorovanie terapeutickej rezistencie a predpovedanie prognózy u pacientov s rakovinou v dôsledku významných rozdielov v prežívaní tohto kritéria108 . Napríklad, keďže základná prítomnosť celkových CTC pri pokročilom NSCLC poskytla zlú prognózu109 a prítomnosť viac ako piatich EMT-CTC indikovala progresívne ochorenie110 . Zistilo sa, že rôzne počty celkových CTC a EMT CTC hrajú dôležitú úlohu pri určovaní prognózy pacientov s rakovinou prsníka. Je zaujímavé, že sa zdôraznilo, že lepšie pochopenie podtypov EMT-CTC a ich interakcií s mononukleárnymi bunkami periférnej krvi by mohlo pomôcť navrhnúť lepšie antimetastatické liečby111 . Keďže CTC EMT-pozitívni pacienti s pomerom neutrofilov k lymfocytom ≥3 mali 8,6-krát zvýšené riziko recidívy ochorenia v porovnaní s CTC EMT-negatívnymi pacientmi s nižšími hladinami neutrofilov, skóre založené na zápale zvýšilo prognostickú hodnotu CTC pri primárnom karcinóme prsníka 112 . Preto zacielenie na dráhu EMT môže zabrániť šíreniu nádorových buniek u pacientov v ranom štádiu a eradikovať metastatické bunky v pokročilých štádiách.

Stonka CTC
Mnoho predchádzajúcich štúdií naznačilo subpopuláciu agresívnych CTC so znakmi „stonky“ pri rôznych rakovinách, čo sa týka ich vlastností pre samoobnovu a indukciu rastu nádoru. Pri rakovine močového mechúra štúdie uvádzajú vysokú expresiu OCT4, kľúčového proteínu udržiavajúceho kmeň113 , v podskupine CTC114 . Pri rakovine prsníka sa uvádza, že fenotypy buniek CD44 + /CD24- /low a aldehyddehydrogenázy 1 (ALDH1)+ sú spojené s kmeňovosťou. Po detekcii expresie CD44, CD24 a ALDH1 CTC u 30 pacientov s metastatickým karcinómom prsníka Theodoropoulos et al. zistili, že 35,2 % z 1439 CTC bolo CD44 + /CD24- /nízke a 17,7 % z 238 CTC bolo ALDH1 vysoké /CD24- /nízke , čo poskytuje dôkaz o kmeňovosti CTC96 . Bunková línia CTC-3 vytvorená z buniek periférnej krvi pacienta s rakovinou prsníka vykazovala agresívnejší rast ako široko používaná bunková línia rakoviny prsníka MCF-7. Génové profilovanie odhalilo vyššiu expresiu kmeňových markerov v bunkovej línii CTC-3 v porovnaní s bunkami MCF- 7115 . Pri hepatocelulárnom karcinóme (HCC) bolo 71,4 % pacientov s HCC CTC pozitívnych na marker rakovinových kmeňových buniek, CD44; mali teda významnú populáciu CTC s kmeňovými vlastnosťami, ktoré by mohli prispieť k prežitiu a šíreniu nádorových buniek116 . V glioblastóme analýza RNA-seq odhalila kmeň a chemorezistenciu v CTC117 indukovanú aktiváciou Wnt . Pri rakovine prostaty bol marker kmeňových buniek CD133 pozorovaný u väčšiny (> 80 %) CTC pacientov s metastatickým karcinómom prostaty rezistentným na kastráciu 97 a kmeňová subpopulácia CXC motívu chemokínového receptora 4+/CD133+CTCs bola viac prevláda v EpCAM-negatívnych CTC ako v EpCAM-pozitívnych CTC118 .

Je dôležité porozumieť mechanizmom regulujúcim kmeň CTC a interferencia s vlastnosťami kmeňa subpopulácie CTC môže účinnejšie potlačiť progresiu a relaps rakoviny. CTC podliehajú značným úrovniam šmykového toku tekutiny počas ich šírenia a samotný šmykový tok tekutiny môže mať vplyv na CTC. Použitím modelu rakoviny prsníka s metastázami v mozgu sa navrhlo, že hemodynamický šmykový tok by mohol upregulovať kmeňové gény CTC pri prežívaní v podmienkach šmykového toku119 . Prechod CTC podobný EMT prostredníctvom downregulácie signalizácie ERK a GSK3p by mohol podporiť konverziu CTC na kmeňové CTC s vysokou schopnosťou vytvárať sféry a iniciovať nádor120.

CTC a krvné mikroprostredie
Keď sú transportované v krvnom riečisku, väčšina CTC je obmedzená škodlivým šmykovým stresom alebo zomrie na anoikis, mechanizmus programovanej bunkovej smrti v dôsledku straty bunkovej väzby121,122 . Len malá časť CTC úzko interaguje s krvnými doštičkami, neutrofilmi , makrofágmi , myeloidnými supresorovými bunkami (MDSC) alebo fibroblastmi spojenými s rakovinou (CAF), aby unikli imunitnému systému a podporili ich prežitie123,124 . Nedávno hromadiace sa štúdie naznačujú, že interakcia a modulácia medzi CTC a nepriateľským krvným mikroprostredím je nevyhnutná pre adhéziu k endotelovým bunkám, inváziu tkaniva a metastázy nádoru (obr. 3 ).

CTC v krvnom mikroprostredí a ich interakcia s neutrofilmi, krvnými doštičkami, CAF a TAM. CAF: fibroblasty spojené s rakovinou, TAM: makrofágy spojené s nádorom

Interakcia CTC s neutrofilmi
Neutrofily sú najpočetnejšie cirkulujúce leukocyty u ľudí a nedávno boli študované na podporu progresie rakoviny125 . Zvýšený počet neutrofilov v obehu je spojený so zlou prognózou pri niekoľkých typoch rakoviny 126 , 127 , 128 . Tvorba zhlukov CTC-bielych krviniek (WBC) bola predtým hlásená v krvnom obehu 129 . V roku 2019 Szczerba a spol. určili, že CTC boli významne spojené s neutrofilmi u myších modelov aj u pacientov s rakovinou prsníka, pričom vykazovali väčší metastatický potenciál s väčšou expresiou génov, ktoré zahŕňajú progresiu bunkového cyklu v porovnaní so samotnými CTC130 . Tieto pozorovania sú v súlade s predchádzajúcimi zisteniami, ktoré ukazujú proliferačnú úlohu neutrofilov na nádorových bunkách131 . Väzba CTC a neutrofilov je sprostredkovaná bunkovým spojením a pravdepodobne vyžaduje adhéznu molekulu vaskulárnych buniek 1 130 . Okrem toho môžu neutrofily priamo adherovať na CTC prostredníctvom interakcie Mac-1/ICAM-1 a pôsobiť ako most medzi nádorovými bunkami a pečeňovým parenchýmom, čím podporujú extravazáciu a pečeňové metastázy132 . CTC sa teda zhlukujú s neutrofilmi ukotvenými vo vaskulárnom endoteli pre extravazáciu, pričom odolávajú šmykovému namáhaniu a proces je sprostredkovaný sériou bunkových adhéznych proteínov, ako je kadherín, integrín a povrchový glykoproteín133,134,135 . Je zaujímavé, že Chen a kol. zistili, že IL-8 vylučovaný z neutrofilov bol nevyhnutný pre sekvestráciu neutrofilov so zastavenými nádorovými bunkami a pre extravazačné správanie susedných nádorových buniek cez endoteliálnu bariéru136 .
Neutrofily môžu tiež podporovať metastázy nepriamo. Neutrofilné extracelulárne pasce (NET) sú sieťovité štruktúry tvorené komplexmi DNA-histón a proteínmi uvoľnenými z aktivovaných neutrofilov so schopnosťou ovplyvniť biológiu CTC 137 . Mnohé štúdie zistili , že NET boli schopné zachytiť CTC v obehu, a tým podporili metastatickú disemináciu138,139 . Experimenty in vitro a in vivo ukázali, že adhézia CTC k NET je sprostredkovaná p1-integrínom exprimovaným na NET aj rakovinových bunkách, pričom tento účinok bol zrušený po podaní DNAázy I139 . V myšom modeli chirurgického stresu spustila tvorba NET uvoľnenie vysokomobilného skupinového boxu 1, ktorý aktivoval TLR9-sprostredkované dráhy v CTC, a preto urýchlil progresiu pečeňových metastáz 140 . Okrem toho môžu NET tiež prebudiť spiace rakovinové bunky a podporovať metastázy. Nedávno Albrengues a spol. elegantne demonštrovali, že dve proteázy spojené s NET, neutrofilná elastáza a matricová metaloproteináza 9 (MMP9), sa koncentrujú na laminíne, provokujú jeho štiepenie vytvorením epitopu, ktorý indukuje prebudenie spiacich rakovinových buniek aktiváciou integrínu a signalizáciou FAK/ERK/MLCK/YAP 141 . Na druhej strane sa ukázalo, že proteín exprimovaný v nádore, ako je proteáza katepsín, podporuje pľúcne metastázy rakoviny prsníka tým, že podporuje tvorbu NET v metastatických výklenkoch142 . Coiled-coil doména obsahujúca proteín 25, ďalší proteín exprimovaný na membráne rakovinových buniek, by mohol slúžiť ako špecifický senzor pre komponent DNA NETs, ktorý indukuje migráciu a adhéziu nádorových buniek143 . Okrem toho, tvorbou NET môžu cirkulujúce neutrofily pomôcť CTC uniknúť imunitnému dohľadu potlačením aktivácie periférnych leukocytov144 , funkcie prirodzených zabíjačov (NK) buniek145 , protinádorovej odpovede efektorových T buniek146 a dokonca aj spoluprácou s inými imunitnými bunky (ako sú y5T bunky produkujúce IL17) 147 . Celkovo existujú dôkazy o prometastatickej úlohe neutrofilov v ich interakcii s CTC, ale konkrétny mechanizmus je potrebné podrobnejšie objasniť.

Interakcia CTC s makrofágmi
Makrofágy spojené s nádorom (TAM) nielen prispievajú k progresii metastáz v rámci primárneho nádoru, ale podporujú aj neskoršie štádiá metastáz vrátane šírenia a extravazácie CTC148 . Hamilton a kol. pokúsili skúmať interakcie CTC-makrofág spoločnou kultiváciou mononukleárnych buniek periférnej krvi s bunkovými líniami CTC získanými od pacientov s malobunkovým karcinómom pľúc. Zistili, že CTC boli schopné indukovať diferenciáciu monocytov na TAM, ktoré vylučujú množstvo mediátorov , ako je osteopontín, MMP9, chitináza -3-1 a faktor krvných doštičiek, aby podporili ďalší nábor, migráciu a inváziu leukocytov149,150 . V ďalšej štúdii kolorektálneho karcinómu je spätná väzba medzi TAM a rakovinovými bunkami nevyhnutná pre program EMT CTC a intravazáciu do krvného obehu. Mechanicky IL6 odvodený z TAM reguluje invazívnosť prostredníctvom dráhy STAT3/miR-506-3p/FoxQ1, čo zase zvyšuje expresiu CCL2 nádorových buniek edukovaných TAM, čím pomáha získavať makrofágy151 . Zdá sa, že TAM podporujú CTC získavanie mechanickej priľnavosti a odolnosti, čím im pomáhajú vytvárať ochranné bunkové zhluky a poskytujú odolnosť voči šmykovému namáhaniu 152 . Fúzia makrofágov a nádorových buniek by mohla byť potenciálnym mechanizmom imunitného úniku a invázie. Ukázalo sa , že tieto hybridy makrofágov a nádorových buniek majú makrofágové fenotypy podobné M2 (CD163), ako aj epitelové markery (EpCAM) 153,154 a boli izolované z krvi pacientov s viacerými rakovinami, ako je PDAC155 , melanóm154 , rakoviny prsníka, vaječníkov a kolorekta 156 . Okrem toho, keď sa transplantovali myšiam, rozšírili sa široko a vytvorili lézie vo vzdialených tkanivách 154 , 155 . Nedávna štúdia Gasta a kol. odhalili, že fúzne hybridy môžu zvýšiť heterogenitu nádoru a metastatické správanie, čo ďalej koreluje so štádiom ochorenia a celkovým prežitím u niekoľkých druhov rakoviny 157 . Okrem toho väčšie hybridné veľkosti boli tiež spojené s horším prežitím u pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc 158 . Pochopenie mechanizmu priamej interakcie a molekulárnej fúzie medzi CTC a makrofágmi má veľký význam pre identifikáciu terapeutických cieľov.

Interakcia CTC s krvnými doštičkami
Metastáza a progresia rakoviny sú výrazne ovplyvnené náborom a aktiváciou krvných doštičiek, ktoré podporujú prežitie CTC, ako aj ich výsev a rast na sekundárnych miestach 159 , 160 . Krvné doštičky sa môžu viazať a vytvárať agregáty s CTC v krvnom obehu a CTC rozširujú tvorbu agregácie uvoľňovaním protrombotických a prokoagulačných mikročastíc alebo expresiou tkanivového faktora 161,162 . Zistilo sa , že mediátory uvoľňujúce krvné doštičky, ako je TGF-p, urýchľujú EMT v CTC a podporujú inváziu a metastázy163,164 . Xiong a kol. nedávno zistili, že expresia proteínu tepelného šoku 47 bola indukovaná počas EMT, čo zvýšilo interakciu rakovinových buniek a krvných doštičiek prostredníctvom jeho závislej sekrécie kolagénu v bunkách rakoviny prsníka 165 . Je zaujímavé, že sa predpokladá, že krvné doštičky chránia CTC proti mechanickému namáhaniu 166 a vyvolávajú rezistenciu voči anoikis, ktorá je sprostredkovaná aktiváciou dráhy YAP1 167 . Okrem toho krvné doštičky podporujú únik CTC z útoku NK buniek prostredníctvom rôznych mechanizmov vrátane (1) agregátov krvných doštičiek, ktoré vytvárajú povrchové tienenie na obranu cytolyzačného účinku NK buniek; 168 (2) normálny MHC-I odvodený z krvných doštičiek, ktoré sú prenesené na povrch nádorovej bunky, čím bránia identifikácii NK buniek; 169 (3) downregulácia prirodzenej zabíjačskej skupiny 2, člena D (NKG2D) v NK bunkách TGF-β odvodeným od krvných doštičiek, ako aj uvoľňovanie ligandov NKG2D sprostredkované krvnými doštičkami, ktoré prispievajú k zhoršenej protinádorovej cytotoxicite; 170 , 171 a (4) glukokortikoidom odvodený ligand príbuzný TNF odvodený od krvných doštičiek, ktorý aktivuje GITR v NK bunkách a znižuje ich cytotoxicitu172 . Okrem toho NK bunky a krvné doštičky môžu tiež interferovať s neutrofilmi, T bunkami a makrofágmi a modulovať ich imunitnú funkciu173,174,175 . Okrem ochrany CTC v krvnom obehu sa krvné doštičky podieľajú aj na adhézii endotelových buniek. Prichytenie krvných doštičiek a CTC je sprostredkované receptormi adhézie krvných doštičiek, ako je integrín aIIbp3 a P-selektín, čím sa podporuje pevná priľnavosť CTC k stene endotelu 176 , 177 , 178 . Okrem toho krvné doštičky aktivované nádorovými bunkami uvoľňujú ATP z hustých granúl, čo potom indukuje aktiváciu endotelového receptora P2Y2 a umožňuje transendotelovú migráciu nádorových buniek zvýšením permeability179. Jedna štúdia tiež odhalila, že súhra medzi integrínom a6p1 na krvných doštičkách a jeho receptorom, dezintegrínom a metaloproteázou 9 na CTC, je nevyhnutná pre proces extravazácie rakovinových buniek180 . Krvné doštičky by tiež mohli zvýšiť vaskulárnu permeabilitu, aby pomohli extravazácii nádorových buniek. Napríklad predklinický model pľúcnych metastáz ukázal, že CD97 spojený s nádorovými bunkami, receptor spojený s G proteínom, môže iniciovať aktiváciu krvných doštičiek, čo vedie k sekrécii granúl, vrátane uvoľňovania ATP aj kyseliny lyzofosfatidovej181 . Podobne sa zistilo, že súhra medzi doštičkovo špecifickým receptorovým glykoproteínom VI a jeho ligandom galektínom-3 exprimovaným na bunkách rakoviny hrubého čreva a prsníka podporuje aktiváciu krvných doštičiek a sekréciu ATP182 . V dôsledku toho tieto sekrécie krvných doštičiek podporujú proces nádorových metastáz reguláciou vaskulárnej permeability. Nedávno Xu a spol. zistili, že Ptx@AlbSNO môže blokovať funkcie krvných doštičiek špecifické pre nádor na potlačenie EMT nádoru, ako aj na zabránenie adhézie krvných doštičiek okolo CTC. Ptx@AlbSNO môže tiež inhibovať sekréciu TGF-β a zvýšiť intratumorálnu infiltráciu imunitných buniek, aby sa zvrátil imunosupresívny TME, čím sa potláčajú vzdialené metastázy183 . Celkovo vzaté, úzky a komplexný presluch medzi CTC a krvnými doštičkami môže zahŕňať odlišné varianty molekúl a signálne dráhy a môže predstavovať sľubnú protinádorovú stratégiu, ktorá je obzvlášť atraktívna na liečbu niekoľkých druhov rakoviny.

Interakcia CTC s MDSC
MDSC sú heterogénnou podskupinou myeloidných buniek charakterizovaných imunosupresívnymi vlastnosťami, ktoré tiež podporujú metastatické šírenie. Podľa štandardného protokolu na izoláciu ľudských MDSC Cassetta et al. zistili, že polymorfonukleárne (PMN)-MDSC boli významne rozšírené medzi väčšinou typov rakoviny okrem melanómu v porovnaní s infekciou a zápalom184 . Predpokladá sa, že klastre CTC-MDSC sa vyhýbajú imunitnému dohľadu nad odpoveďou T buniek185 . Pokles cirkulujúcich MDSC bol skutočne spojený so zvýšením aktivovaných OX40+PD-1- T buniek u pacientov s difúznym veľkobunkovým B- lymfómom186 . Okrem toho Sprouse a kol. zistili, že in vitro kokultivácia CTC odvodených od pacientov s melanómom a rakovinou prsníka a PMN-MDSC zvýšila aktiváciu Notch v CTC prostredníctvom priamej interakcie medzi Jagged1 (ligandy Notch1) exprimovaným na MDSC a receptorom Notch1 exprimovaným na CTC. Zvýšená produkcia produkcie reaktívnych foriem kyslíka v MDSC by mohla zvýšiť expresiu receptora Notch1, čím by sa podporila proliferácia CTC187 . Potenciálne mechanizmy, ktoré sú základom súhry medzi CTC a MDSC, sa ešte musia určiť.

Interakcia CTC s modelmi CAF
CAF sú jednou z najrozšírenejších zložiek v TME a zohrávajú významnú úlohu pri iniciácii nádoru, angiogenéze, metastázovaní a rezistencii voči liekom188 . Mechanicky CAF remodelujú štruktúru extracelulárnej matrice, ktorá umožňuje nádorovým bunkám preniknúť cez strómu a komunikovať s rakovinovými bunkami vylučovaním rastových faktorov, chemokínov a cytokínov 189 . Málo sa však vie o súhre medzi modelmi CAF a CTC. Duda a spol. najprv demonštrovali, že CTC môžu prenášať CAF z primárneho nádoru do metastatického miesta na myšacích modeloch metastáz rakoviny pľúc190 . Tieto CAF odvodené od hostiteľa priamo zvyšujú prežitie nádorových buniek a podporujú tvorbu metastáz, zatiaľ čo vyčerpanie CAF z pľúc významne znižuje počet makroskopických metastáz a predlžuje mieru prežitia u myší. Okrem toho môžu CAF chrániť CTC pred šmykovými silami tekutiny počas procesu šírenia 191 . V trojrozmernom kokultivačnom modeli sa zistilo, že CAF indukujú šmykovú odolnosť voči nádorovým bunkám prostaty prostredníctvom stabilného medzibunkového kontaktu, ako aj rozpustné faktory (ako sú CXCL5, CCL2 a CCL7), ktoré sú spojené s prežitím buniek, inváziou a EMT. Okrem experimentálnych modelov boli cirkulujúce CAF (identifikované koexpresiou FAP a α-SMA) detegované v periférnej krvi pacientov s metastatickým karcinómom prsníka, ale nie u pacientov v skorých štádiách192 a vykazujú vynikajúcu presnosť v metastázach. diagnóza (AUC–ROC, 0,975), keď bola izolovaná pomocou novej akustickej mikrostreamingovej platformy193 .
Technológie na obohacovanie a izoláciu CTC

V posledných rokoch bolo navrhnutých mnoho metód na zachytenie CTC. Kvôli extrémne malému podielu CTC v krvi pacientov je stále veľkou výzvou presne izolovať CTC z mnohých krvných buniek a najmä vynájsť použiteľné metódy, ktoré dokážu efektívne odhaliť životaschopné CTC pre následnú hĺbkovú analýzu. Tu budeme diskutovať o vývoji technológií súvisiacich s CTC za posledné dve desaťročia, pretože zaznamenali obrovský rast. Zdôrazníme najinovatívnejšie metódy spojené s materiálmi nanometrov alebo novými mikrofluidnými čipmi v nádeji, že poskytneme užitočný rámec technológií súvisiacich s CTC.

Vo všeobecnosti existujú tri základné stratégie technológií CTC194 , ktoré zahŕňajú (1) zachytávanie a obohacovanie, (2) detekciu a identifikáciu a (3) uvoľnenie. Prvá stratégia zachytávania a obohatenia zahŕňa špecifickú interakciu medzi CTC a materiálmi prostredníctvom fyzikálnych interakcií alebo interakcií protilátka-antigén. Druhá stratégia detekcie, ktorá znamená identifikáciu CTC, sa týka rôznych metód, ako je fluorescenčná mikroskopia, fluorescenčná spektrofotometria, prietoková cytometria, Ramanov rozptyl so zosilneným povrchom alebo elektrická impedancia. V poslednej stratégii sa uvoľnené CTC používajú hlavne na následnú analýzu, ako je genomika, transkriptomika, proteomika a kultúra CTC.

Klasické technológie súvisiace s CTC založené na fyzikálnych vlastnostiach
Fyzická separačná metóda obohatenia CTC je založená na rozdieloch medzi CTC a krvnými bunkami vo veľkosti, hustote, deformovateľnosti a elektrických vlastnostiach. Systém 195 izolácie podľa veľkosti epitelových nádorových buniek môže filtrovať vzorky krvi cez polykarbonátovú membránu typu TRACK-ETCH s priemerom 8 μm, ale má nízku účinnosť. Vylepšená metóda, ktorá pozostáva zo systému regulácie tlaku, pružného mikropružinového zariadenia 196 , dosahuje účinnosť záchytu 90 % s detekciou CTC v 76 % vzoriek. Existujú však rôzne trendy v počte CTC pozorované z rôznych vzoriek, takže táto metóda nie je spoľahlivá pre široké použitie. CTC možno triediť aj pomocou systému Oncoquick 197 , techniky závislej od hustoty, ktorá umožňuje filtráciu červených krviniek a bielych krviniek, alebo pomocou Apostream 198 , ktorý využíva techniky dielektrickej elektroforézy v mikrofluidnej komore na zachytenie CTC. Tieto systémy vyžadujú veľký objem krvi a nemôžu zbierať CTC podobnej veľkosti ako WBC, čo sú ich hlavné obmedzenia. Celkovo sú metódy založené na fyzikálnych vlastnostiach všeobecne neefektívne, majú nízku čistotu a nedostatočnú špecifickosť, hoci vitalita je dobrá a náklady sú relatívne lacné.

Klasické technológie súvisiace s CTC založené na biologických vlastnostiach
Technológia založená na biologických vlastnostiach je ďalšou dôležitou metódou detekcie CTC. Na základe interakcie protilátka-antigén sú CTC zvyčajne pozitívne obohatené pomocou epitelových (EpCAM) a mezenchymálnych (vimentín) markerov, ako aj negatívne obohatené použitím CD45 na vyčerpanie nežiaducich leukocytov199 . Techniky závislé od EpCAM sú najčastejšie používané výskumníkmi. Systém CellSearch 200 , jediné zariadenie schválené FDA na klinické použitie, využíva feromagnetické guľôčky potiahnuté protilátkou EpCAM na obohatenie CK + /CD45-/DAPI + CTC a odstránenie CK-/CD45 + /DAPI + WBC. Avšak CTC silne priľnú k povrchu zariadenia v metódach založených na interakcii protilátok, čo sťažuje ich uvoľnenie. Tento nedostatok môže byť vyriešený v inom EpCAM závislom systéme MagsWeeper 201 , ktorý používa magnetickú tyč na obohatenie CTC a elimináciu buniek neviazaných na magnetické guľôčky, čo umožňuje uvoľnenie CTC pre nasledujúcu biochemickú analýzu. Canpatrol TM 202 je ďalším predstaviteľom EpCAM-dependentnej techniky, ktorá poskytuje morfologickú, cytologickú a genetickú charakterizáciu jednotlivých CTC. Stručne povedané, techniky založené na EpCAM sú široko používané. Avšak, pretože povrchový antigén CTC má vysokú heterogenitu, CTC, ktoré majú nízku expresiu EpCAM, nemusia byť obohatené, čo spôsobuje nepresné výsledky, zatiaľ čo metódy založené na fyzikálnych vlastnostiach nemajú toto obmedzenie. Pozornosť výskumníkov si preto postupne získalo kombinovanie výhod rôznych technológií alebo hľadanie CTC s vysokou citlivosťou a špecifickými nádorovými markermi.

Nedávno, s vývojom mikrofluidných čipov, nanomateriálov a sekvencovania novej generácie, majú výskumníci veľa pokročilých technológií na stimuláciu pokroku v technológiách súvisiacich s CTC. Dôležité je, že výskumníci sa snažia dosiahnuť vyššiu úroveň technológií súvisiacich s CTC v niekoľkých kľúčových parametroch: výťažok, čistota, pomer obohatenia, priepustnosť, životaschopnosť, citlivosť, špecifickosť, rýchlosť uvoľňovania, dostupnosť pre ďalšiu analýzu a jednoduchosť prevádzky zariadenia).

Najnovšie technológie súvisiace s CTC: techniky založené na mikrofluidoch a nanotechnológiách
Okrem klasických technológií súvisiacich s CTC diskutovanými vyššie boli vyvinuté niektoré novšie technológie, ako sú techniky založené na mikrofluidoch a nanotechnológiách. Mikrofluidické prístupy k triedeniu buniek využívajú „vnútorné“ (napr. dynamické sily tekutiny) oproti „vonkajším“ vonkajším silám (napr. magnetické, elektrické pole, akustické a optické sily) na oddelenie buniek a potom vyberte cieľové bunky zo vzorky heterogénne bunky prostredníctvom rôznych fyzikálnych a biologických vlastností 203 . CTC čip je silikónová mikrofluidná platforma, na ktorej sú CTC zachytené na sklíčkach potiahnutých molekulárnym markerom. CTC čip 204 dokáže oddeliť životaschopné CTC z plnej krvi bez predbežného označovania alebo spracovania vzoriek, čo vedie k zvýšenej bunkovej aktivite a čistote separácie. Upravená platforma založená na čipe využívajúca zlaté nanočastice na čipe rybej kosti (NP- HB CTC-Chip 205 ) ľahko oddeľuje životaschopné CTC a bezpečne uvoľňuje bunky na ďalšiu analýzu pomocou reakcie chemickej výmeny ligandov s nanočasticami zlata na čipe rybej kosti. Okrem toho má monolitický CTC-iChip 206 vysokoúčinnú depléciu WBC a umožňuje charakterizáciu CTC s epiteliálnymi a mezenchymálnymi charakteristikami. Hoci tieto mikrofluidné čipy výrazne prispeli k vývoju detekcie CTC (tj zlepšenej účinnosti zachytávania, životaschopnosti a vyčerpania bielych krviniek), nie sú široko používané na klinické použitie kvôli obmedzeniam, medzi ktoré patrí dlhý čas nastavenia, vysoké počiatočné náklady, objemné prístrojové vybavenie a obmedzená schopnosť vykonávať jednobunkovú molekulárnu analýzu.

V snahe zachytiť CTC automatizovaným spôsobom (tabuľka 2 ), Zhang et al. úspešne triedili bunky MCF-7 z 5 ml objemu zriedenej krvi do 23 m s mierou obnovy 85 % 207 . Ešte pozoruhodnejšie je, že Jia a kol. vyvinuli menej nákladný samoriadiaci mikrodutinový čip na dosiahnutie načítania buniek, lýzy, izotermického zosilnenia a čítania signálu na jedinom čipe 208 . Tento nový čip dokáže vykonávať genetickú analýzu na úrovni jednotlivých buniek, má veľký potenciál v personalizovanej terapii a monitorovaní účinnosti. Okrem toho ďalší automatizovaný a integrovaný mikrofluidný systém navrhnutý Wangom a kol. sa uvádza, že dosiahne zachytenie a identifikáciu CTC do 90 m. S výhodami automatizácie, stability, hospodárnosti a užívateľsky prívetivej prevádzky poskytuje tento systém široké vyhliadky na skríning a prognózu rakoviny, najmä pri HCC 209 . Okrem toho Lee a kol. vynašiel integrovaný systém na báze mikrofluidov na dosiahnutie súčasnej izolácie na čipe a charakterizáciu cirkulujúcich nádorov s využitím rozdielov v gradiente magnetického poľa a imunitnej fluorescencii. Okrem toho tento nový systém dokáže na čipe rozlíšiť osem rôznych podtypov heterogénnych CTC, čo vedie k diagnóze a prognóze rakoviny prsníka210 . Kombináciou mikrofluidnej technológie a techník molekulárneho profilovania in situ má čipová platforma On-chip Post-processing Enabling schopnosť vykonávať molekulárne analýzy jedného CTC z pacientov s metastatickým karcinómom prsníka a metastatickým karcinómom pankreasu bez akýchkoľvek procesov mimo čipu, čo naznačuje jeho potenciálna implementácia včasnej molekulárnej detekcie metastáz rakoviny 211 . Menej nákladné automatizované a integrované mikrofluidné systémy, ktoré umožňujú jednoduchú detekciu CTC a analýzu buniek, majú spolu veľkú klinickú hodnotu.

Tabuľka 2 Technológie detekcie CTC za posledné tri roky (od roku 2018 do roku 2021), najmä vrátane metód mikrofluidných čipov a metód založených na nanotechnológii

S pokrokom v oblasti nanomateriálov sa metódy založené na nanotechnológiách stávajú sľubnými nástrojmi na detekciu CTC v počiatočnom štádiu ochorenia a na monitorovanie vývoja rakoviny, ako aj zobrazovanie in vivo 212 . Nanomateriály majú veľký pomer povrchu k objemu a umožňujú izoláciu CTC pri vysokej špecifickosti a detekciu CTC pri vysokej citlivosti tým, že adsorbujú množstvo cieľových ligandov na naviazanie špecifických molekúl na rakovinové bunky. V súčasnosti štúdie uvádzajú mnohé typy nanomateriálov (tabuľka 2 ) na detekciu CTC, vrátane magnetických nanočastíc 213 , 214 , 215 , 216 , 217 , nanočastíc zlata 218 , 219 , 220 a kvantových , 22221 bodov 221 . Štúdie napríklad ukázali, že využitie magnetických nanočastíc214 funkcionalizovaných kyselinou trieslovou , magnetických nanohybridov CoFe2O4@Ag216 a magnetických nanočastíc na báze peptidov213 zvyšuje účinnosť zachytávania CTC u pacientov s rakovinou prsníka. Medzi nimi magnetické nanočastice na báze peptidov dokážu rozlíšiť epitelové a mezenchymálne podskupiny CTC a umožňujú analýzu na úrovni jednej bunky, ktorej detekčné účinky sú podporované magnetickými nanočasticami a integrovanými systémami na báze mikrofluidov 210 . Pokiaľ ide o nanočastice zlata, došlo k významnému vývoju. Napríklad cytosenzor navrhnutý Yangom a kol. 224 vykazovali vynikajúci analytický výkon so širokým lineárnym rozsahom, uspokojivým uvoľňovaním CTC (93,7–97,4 %) a dobrou životaschopnosťou buniek. Liu a kol. uviedli, že nanovrstvy čierneho fosforu modifikované nanočasticami zlata zlepšili stabilitu pri detekcii CTC218 . Okrem toho kombinácia mikrofluidného systému a nanočastíc zlata predstavuje širšiu škálu aplikácií. Wang a kol. syntetizovať medzifázový povlak oxidu zinočnatého s nanoštruktúrou na povrchu mikroguľôčok, čo zväčšuje špecifický povrch a tým vedie k zlepšenej účinnosti zachytávania CTC225 . Navyše, využitie viacfarebných magnetických povrchovo vylepšených Ramanových rozptylových nanotagov a čipovej imunomagnetickej separácie by mohlo kvantitatívne a simultánne detekovať štyri rôzne povrchové proteínové markery na jednotlivých nádorových bunkách, čím by sa uľahčilo oddelenie CTC subpopulácií 217 .
Hoci techniky založené na nanotechnológiách môžu poskytnúť široké vyhliadky na výskum CTC v rôznych nádoroch nákladovo efektívnym a jednoduchým spôsobom, existujú obmedzenia a výzvy. Po prvé, mnohé faktory (napr. väzba nanočasticových sond, agregácia) môžu ovplyvniť detekciu založenú na nanočasticiach, čo vedie k zníženiu spoľahlivosti a reprodukovateľnosti. Po druhé, väčšina testov na báze nanočastíc sa pripravuje na akademické štúdie a stále sú nereálne pre široko klinický preklad. Po tretie, existuje možná toxicita nanočastíc.
V ére presnej medicíny má analýza CTC veľkú klinickú hodnotu. Ak majú pracovníci robiť svoju prácu dobre, nástroje sa musia najskôr nabrúsiť. Preto sú technológie súvisiace s CTC základným základom pre aplikáciu CTC v presnej medicíne. Tu sme preskúmali predchádzajúce technológie súvisiace s CTC založené na fyzikálnych a biologických vlastnostiach a najnovší vývoj techník spojených s prístupmi založenými na mikrofluidoch a nanočasticiach. Aj keď medzi rôznymi metódami existujú silné a slabé stránky, veríme, že efektívna kombinácia týchto techník môže byť prínosom pre výskum CTC mnohými spôsobmi, najmä pokiaľ ide o hĺbkovú analýzu a možnosti v klinických aplikáciách.
Klinické aplikácie CTC
Klinicky sa CTC teraz používajú ako náhradné biomarkery pre mnohé solídne rakoviny. Uskutočnilo sa množstvo štúdií, najmä pri rakovine prsníka, rakovine prostaty, rakovine pľúc, rakovine pečene, rakovine pankreasu, rakovine žalúdka a melanóme. Hoci klinické usmernenia nezahŕňali klinické použitie CTC, okrem zaradenia CTC do klasifikácie nádorov cM0 (t. j. žiadne klinické prejavy zjavných metastáz, ale detekcia nádorových buniek v krvi), mnohé štúdie predpovedali veľký potenciál CTC v klinických aplikáciách. V tejto časti predstavíme najmä úlohu CTC ako biomarkerov na diagnostiku, prognostiku a monitorovanie terapie pri rôznych rakovinách (obr. 4 ).

Prehľad izolácie a detekcie CTC, charakterizácie a klinických aplikácií

Včasná diagnostika rakoviny
Ako neinvazívna metóda je detekcia CTC atraktívna pri diagnostike rakoviny. Štúdie CTC používané na včasnú diagnostiku rakoviny v posledných troch rokoch sú uvedené v tabuľke 3 . Nádorová lézia už má viac ako 109 nádorových buniek v čase, keď sú detekovateľné u pacientov pomocou súčasných zobrazovacích postupov 15 , ako je počítačová tomografia, magnetická rezonancia a pozitrónová emisná tomografia. Čo najskoršia diagnostika rakoviny, najmä v prípade rýchlo progredujúcej rakoviny, je najlepší spôsob, ako ich poraziť. Štúdie zistili, že CTC korelujú so štádiom nádoru, ale klinická užitočnosť CTC pri detekcii rakoviny alebo dokonca pri včasnej diagnostike rakoviny je stále predmetom diskusie. CTC sa považujú za náhradný marker metastatickej aktivity, ale to, či sa metastatické šírenie CTC u pacientov vyskytuje včas počas tvorby nádoru, je stále kontroverzné. Na myších modeloch sa však zistila skorá diseminačná metastáza v karcinogenéze prsníka 226 , 227 a pankreasu 228 , 229 , čo naznačuje, že cirkulácia CTC je pravdepodobne veľmi skorým javom v progresii rakoviny. V štúdii Barrière et al. 230 boli CTC detegované u 41 % pacientov v štádiu T1 a 47 % pacientov s rakovinou prsníka s negatívnymi axilárnymi lymfatickými uzlinami, pričom obe sú v počiatočnom štádiu rakoviny prsníka. V štúdii Thery et al. 231 miera pozitivity CTC bola 21 % a 24 % pri rakovine prsníka s negatívnymi lymfatickými uzlinami a 24 % s pozitívnou rakovinou prsníka. Na základe tejto hypotézy môžu byť CTC detegované skôr, než je primárny nádor viditeľný na zobrazovacích štúdiách, zatiaľ čo najväčšou výzvou aplikácie CTC pri včasnej diagnostike rakoviny je skutočne ich nedostatok a izolácia. Obmedzená citlivosť metód detekcie CTC bráni ich použitiu ako účinného biomarkera vo včasnej diagnostike rakoviny.

Tabuľka 3 Klinické aplikácie CTC za posledné tri roky (od roku 2019 do roku 2021)

Hodnotenie prognózy rakoviny
Prognostická hodnota CTC bola dôkladne študovaná. CellSearch je jediný klinicky používaný systém na detekciu CTC schválený FDA. Na základe systému CellSearch 46 , 232 , 233 , 234 , 235 , 236 , 237 , 238 , 239 , 240 , 241 , 242 , 243 , 244 , 245 , predstavujú nezávislý prognostický faktor Štúdie hodnotiace iné CTC detekčné systémy ako CanPatol, CTC-čip dosiahli podobné výsledky. Hlavným cieľom vyšetrovania je stanovenie CTC s hraničnou hodnotou ≥ 5 pre pozitivitu, ktorá zvyčajne naznačuje horšiu prognózu. Všeobecne sa predpokladá, že zvýšené počty CTC korelujú s vyššou pravdepodobnosťou metastáz a agresivity rakoviny. V metaanalýze 2239 pacientok s rakovinou prsníka vrátane 21 štúdií 246 mal počet CTC pred neoadjuvantnou chemoterapiou škodlivý a klesajúci vplyv na prežívanie pacientov a pacienti s jedným, dvoma, tromi až štyrmi a piatimi alebo viacerými CTC vykazovali HR. úmrtia (95 % CI) 1,09 (0,65–1,69), 2,63 (1,42–4,54), 3,83 (2,08–6,66) a 6,25 (4,34–9,09). Okrem toho, zvýšené východiskové hladiny CTC boli spojené s horším prežitím, prítomnosť zhlukov CTC často predpovedala zlú prognózu 247 , 248 , 249 a zvyšujúci sa počet CTC alebo nevyčistenie CTC počas liečby bolo tiež prognostickým faktorom horšieho prežitia234 , 250 , 251 . Mnohé štúdie zistili, že molekulárne fenotypy CTC majú silnú prognostickú hodnotu. EMT a stopka sú hlavné molekulárne fenotypy CTC študovaných klinicky. CTC s expresiou markerov súvisiacich s mezenchymálnymi 252 alebo kmeňovými 253 spojenými s horším prežitím. Expresia iných molekulárnych markerov, ako napríklad HER246 , CD47254 , PD-L1254 , má tiež prognostické dôsledky. Väčšina štúdií skúma prognostickú hodnotu CTC v jedinom časovom bode, zatiaľ čo je zaujímavé, že niektoré štúdie zohľadnili dynamiku CTC. Magbanua a kol. 237vyvinuli nový model latentnej zmesi na stratifikáciu skupín s podobnými vzormi trajektórie CTC počas liečebného cyklu a zistili, že analýza sériových CTC môže ďalej stratifikovať pacientov so zlou prognózou do odlišných prognostických podskupín. Dynamické zmeny CTC môžu pôsobiť ako náhradný biomarker prognózy počas dlhého priebehu progresie rakoviny. Vzhľadom na rýchly pokrok v dostupnosti a posilňovaní sekvenčných technológií na úrovni jednotlivých buniek môžeme očakávať, že v budúcnosti môžu genómové/transkripčné profily CTC slúžiť ako vynikajúci prognostický marker, ktorý bude predstavovať komplexnejšie a komplexnejšie biologické informácie. úzko súvisí s prognózou. Štúdie CTC na predpovedanie prognózy v posledných troch rokoch sú zhrnuté v tabuľke 3 .

Monitorovanie terapeutickej odpovede
V mnohých klinických štúdiách boli CTC použité ako užitočné biomarkery na monitorovanie odpovedí na liečbu rakoviny 234 , 255 , 256 , 257 , buď v kombinácii so zobrazovacími vyšetreniami, sérovými biomarkermi alebo samostatne. Výskumníci uprednostňujú zapojenie CTC do hodnotenia terapeutickej účinnosti vzhľadom na vyššiu citlivosť CTC ako v niektorých prípadoch zobrazovacie vyšetrenie 9 . Ako neinvazívna metóda môže detekcia CTC prispieť aj k tomu, aby sa zabránilo častému ožiareniu zo zobrazovacích štúdií počas hodnotenia odpovede na liečbu. Väčšina štúdií zistila, že pokles alebo klírens počtu CTC súvisel s dobrou terapeutickou odpoveďou, zatiaľ čo zvýšenie počtu CTC znamenalo opak 258 , 259 . Smernice RECIST (Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) sú najčastejšie používaným štandardom na hodnotenie terapeutickej odpovede v prípade solídnych nádorov. V niektorých štúdiách však zmeny CTC po liečbe nekorelovali s odpoveďami RECIST u pacientov s rakovinou260 . Hodnotenie CTC v skutočnosti nebolo zahrnuté do usmernení RECIST. Niektoré technológie merania CTC boli nedávno vyvinuté na dosiahnutie genotypizácie pre CTC, ktoré môžu tiež odhaliť kľúčové génové mutácie, ako napríklad ER 39 , 49 , HER2 39 , 49 , EGFR 261 , KRAS 262 a TP53 263 , čím pomáhajú lekárom pri personalizácii liečby. a možnosti rezistencie v čase progresie nádoru. Štúdie využívajúce CTC na monitorovanie odpovede na liečbu v posledných troch rokoch sú zhrnuté v tabuľke 3 .

Objavil sa veľký potenciál CTC v klinickej aplikácii diagnostiky rakoviny, hoci klinicky je jeho použitie ako náhradného biomarkera na skríning rakoviny, monitorovanie liečby a predpovedanie prognóz stále obmedzené. Akonáhle dôjde k metastáze, je zvyčajne ťažké získať opakované biopsie metastatických lézií a rôzne metastázy sú heterogénne dokonca aj u tých istých pacientov. Testovanie CTC pomocou vzoriek periférnej krvi je pohodlné a môže byť reprezentatívnejšie pre znaky metastatických buniek, ktoré sú odvodené od rôznych metastatických lézií u pacientov. Napriek tomu stále chýbajú usmernenia pre klinické použitie CTC, ako je štandardizovaný test na detekciu CTC pre rôzne druhy rakoviny, kombinovaná diagnostická schéma s inými klinickými vyšetreniami a indikácie vhodných časových bodov na odber vzoriek krvi.
Diskusia

Štúdie skúmajúce CTC majú veľký potenciál odhaliť základné procesy metastáz, vrátane mechanizmov zapojených do extravazácie CTC z primárneho nádoru, ako CTC interagujú s krvnými bunkami, aby prežili v obehovom mikroprostredí, a ako CTC prenikajú do vzdialeného metastatického miesta. iniciovať nové lézie. Významné molekulárne vlastnosti CTC môžu výrazne prispieť k identifikácii cieľov pre antimetastatické terapie. Iba malá časť CTC môže nakoniec generovať metastázy, takže štúdie zamerané na tieto silne metastatické CTC môžu poskytnúť hlbší pohľad na terapeutické ciele súvisiace s CTC.

Objavili sa rôzne technológie na detekciu CTC, avšak citlivosť a špecifickosť týchto technológií je ešte potrebné ďalej zlepšovať. Technológia detekcie CTC založená na epiteliálnych markeroch, ako je systém CellSearch, otvorila novú éru pre analýzu CTC a klinické aplikácie, ale ich nevýhody rýchlo uznávajú a oceňujú výskumníci. EMT je kľúčovým znakom metastatických rakovinových buniek, čo naznačuje nedostatočnú účinnosť zachytávania technológie detekcie CTC založenej na epiteliálnych markeroch. Detekčné technológie založené na mezenchymálnych markeroch však môžu byť kontaminované aj inými ako CTC, ako sú fibroblasty spojené s nádorom a endotelové zhluky, ktoré vyvolávajú riziko falošnej pozitivity. Napriek tomu je zaujímavé, že nedávne štúdie uvádzajú, že tieto bunky odvodené od nerakovinových nádorov prezentované u pacientov s rakovinou sú tiež dôležitými náhradnými biomarkermi pre pacientov s rakovinou 264 . Molekulárne markery špecifické pre typ rakoviny pre CTC sú pravdepodobne ďalšou možnosťou, pretože CTC rôznych typov rakoviny majú rôzne molekulárne markery. Senzitivita a špecifickosť známych CTC markerov špecifických pre typ rakoviny však nie sú uspokojivé. Technológie detekcie CTC založené na fyzikálnych vlastnostiach majú tiež problém kontaminácie ne CTC, najmä v prípade tých, ktoré majú podobné fyzikálne vlastnosti ako CTC. Detekčné technológie CTC založené na mikrofluidoch a nanotechnológiách sa v posledných rokoch stali populárnymi, pričom účinnosť týchto technológií si stále vyžaduje ďalšie rozsiahle klinické overenie. Vysoká účinnosť detekcie buniek a schopnosť odstraňovania kontaminácie sú dve kľúčové silné stránky úspešnej technológie detekcie CTC, pričom na dosiahnutie týchto požiadaviek je naliehavo potrebná podstatná technická optimalizácia detekcie CTC.
Chýba komplexná charakteristika CTC. Obmedzené množstvo obsahu genómovej DNA, RNA a proteínov v CTC je prekážkou pri skúmaní ich vlastností genómu, transkriptómu, epigenómu a proteómu. Napriek tomu vznikajúce štúdie genómu a transkriptómu CTC nedávno profitovali z rýchlo sa vyvíjajúcej technológie jednobunkového sekvenovania, zatiaľ čo štúdie proteómov CTC sú stále nepolapiteľné kvôli veľmi obmedzeným technológiám na skúmanie proteómov na úrovni jednej bunky. Štúdium proteómu CTC je však bezprostredné, nielen preto, že môže poskytnúť obraz o biologickej charakterizácii CTC, ale aj preto, že môže pomôcť objaviť CTC špecifické membránové proteíny, ktoré môžu pomôcť optimalizovať detekciu CTC.

Pokiaľ ide o mikroprostredie solídneho nádoru, krvné mikroprostredie okolo CTC tiež zohráva významnú úlohu v prežívaní nádoru a inváznej kapacite. Poznatky o základných mechanizmoch prežitia CTC sú však stále obmedzené, pretože ide o zložitý proces, ktorý zahŕňa nielen šmykové sily a mechaniku tekutín, ale aj rozpustné faktory a extracelulárne vezikuly spojené s nádorom, ktoré tu nie sú podrobne uvedené. Ďalej zostáva potvrdiť, či sú zhluky CTC vhodnejšie na interakciu s inými zložkami krvi alebo na prispôsobenie sa šmykovým silám ako jednotlivé migrujúce CTC. Ak sa skombinujeme so špecifickými biomarkermi na strategickú detekciu CTC a interakciu CTC s pridruženými periférnymi krvnými bunkami, mohli by sme zlepšiť klinickú praktickosť a monitorovaciu silu CTC získaním komplexnejších informácií o nádorovej záťaži a imunitnom stave pacientov.
Hoci CTC preukázali počiatočný sľub v klinických aplikáciách, je potrebné prekonať mnohé výzvy, kým sa analýza CTC bude môcť široko aplikovať na klinike. Dnes klinická aplikácia CTC závisí hlavne od analýzy počítania buniek CTC a molekulárnych fenotypov. Komplexnejšia charakterizácia CTC na základe ich genómu, transkriptómu a proteómu s vysokovýkonným sekvenovaním bude ďalším prínosom pre klinickú aplikáciu, ale tiež zvýši zložitosť a náročnosť analýzy údajov. CTC budú v budúcnosti kľúčovou zložkou „presnej medicíny“, pretože fenotypová, genotypová a funkčná charakterizácia môže poskytnúť príležitosť na štúdium citlivosti na lieky, ktorá súvisí s metastázami. Analýza genómu a transkriptómu CTC môže odhaliť potenciálne ciele liečiv. Životaschopné CTC na testovanie citlivosti/rezistencie na liečivo počas terapeutického kurzu môžu viesť k presnej medikácii. Kultivácia CTC je však veľmi náročná: (1) sú dostupné obmedzené metódy na izoláciu životaschopných CTC, ktoré tiež poskytujú nízky počet CTC a (2) je ťažké napodobniť priaznivé obehové mikroprostredie na prežitie CTC. Boli stanovené veľmi obmedzené bunkové línie odvodené od CTC od pacientov s rakovinou. Bude potrebná optimalizácia kultivačných podmienok CTC.

Okrem toho sú vo vzorkách tekutej biopsie prítomné CTC, cirkulujúca nádorová DNA (ctDNA) a exozómy. Na dosiahnutie presnejšej diagnózy je potrebné preskúmať výhody a nevýhody každého substrátu prítomného v tekutých biopsiách a ako ich lepšie začleniť do klinickej aplikácie. Medzi metódami tekutej biopsie majú CTC obrovské výhody, pretože izolované CTC môžu byť životaschopné, čo môže optimalizovať explantáty odvodené od CTC alebo trojrozmerné organoidné kultúry na funkčné testovanie alebo testy na skríning liekov. Štúdium CTC je atraktívne a detekcia CTC sa pravdepodobne v budúcnosti môže stať základnou súčasťou liečby rakoviny. Keď sa obraz stáva jasnejším, sme si plne istí sľubným potenciálom CTC.

Referencie

Sethi, N. & Kang, Y. Odhalenie zložitosti molekulárneho porozumenia metastáz a cielených terapií. Nat. Rev. Cancer 11 , 735-748 (2011).